นพ. อธิภูมิ เทียมแก้ว
รศ. ดร. นพ. วีรวิทย์ ปิยะมงคล
Basics
โรคโลหิตจางธาลัสซีเมียเป็นโรคที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรมในลักษณะแบบยีนด้อย (autosomal recessive) โดยเกิดความผิดปกติของการสร้างฮีโมโกลบินซึ่งเป็นส่วนประกอบสำคัญในเม็ดเลือดแดง ฮีโมโกลบินทำหน้าที่ในการขนส่งออกซิเจนไปยังส่วนต่างๆของร่างกาย โดยโครงสร้างจะประกอบด้วยฮีม (Heme) และโกลบิน (Globin) ซึ่งฮีโมโกลบินปกติจะประกอบด้วยแอลฟา-โกลบิน 2 สาย (Alpha globin) และสายที่ไม่ใช่แอลฟา-โกลบิน 2 สาย โกลบิน (Non-alpha globin) โดยทั่วไปฮีโมโกลบินที่เป็นชนิดหลักของผู้ใหญ่คือชนิด ฮีโมโกลบินเอ (HbA) ซึ่งประกอบด้วยแอลฟา-โกลบิน 2 สาย และเบตา-โกลบิน 2 สาย (Beta globin) หากเกิดความผิดปกติในการสร้างโกลบินสายแอลฟาหรือเบตา ก็จะเรียกว่าธาลัสซีเมียชนิดแอลฟา (α-thalassemia) และชนิดเบตา (β-thalassemia) ตามลำดับ (1, 2)
การเปลี่ยนแปลงของฮีโมโกลบินในแต่ละช่วงการเจริญ ในช่วงแรกสุด ζ- และ ε-gene จะถูกแปลรหัสออกมาในระยะการเจริญของ Embryo หลังจากนั้นไม่นานก็จะถูกแทนที่ด้วย γ-globin และ α-globin สำหรับฮีโมโกลบินหลักในช่วงที่เป็นทารกในครรภ์ คือ Hb F การสร้าง γ-globin เริ่มขึ้นในช่วงแรกของ Embryogenesis สูงสุดช่วง Midgestation และเริ่มลดลงก่อนคลอด และช่วง 6 เดือนหลังคลอดจะคงเหลือระดับของ γ-globin น้อยมาก ส่วนของ α-globin เริ่มสร้างตั้งแต่ช่วงไตรมาสแรกของการตั้งครรภ์ จนถึงระดับสูงสุดในเวลาไม่นาน และคงอยู่ตลอดชีวิต สำหรับ -globin จะเริ่มสร้างตั้งแต่ช่วงแรกของการตั้งครรภ์ และเพิ่มจนถึงสูงสุดไม่กี่เดือนหลังคลอด ในช่วงผู้ใหญ่ (Adult) จะประกอบด้วย Hb A ประมาณ 97%, Hb A2 ประมาณ 2.5% และ Hb F < 1% ของทั้งหมด (3)
รูปที่ 1 แสดงถึง Hemoglobin switching ในช่วง Embryo, fetus และวัยผู้ใหญ่ (Hematology: Basic Principles and Practice) (1)
Thalassemic syndromes
α-Thalassemia
Molecular Basis of α-Thalassemia
- α-globin gene cluster ประกอบด้วย DNA ประมาณ 30 kb ตำแหน่งอยู่บนแขนข้างสั้นของโครโมโซมคู่ที่ 16 (16p13.3) (1, 4)
- ความผิดปกติของ α-thalassemia ส่วนมากเกิดจากการขาดหายไป (deletions) ของยีนที่สร้างแอลฟาโกลบิน (α genes) โดยอาจขาดหายไป 1 หรือ 2 ตำแหน่ง อย่างไรก็ตามบางส่วนอาจเกิดขึ้นจากความผิดปกติระดับยีนอื่นๆ เช่น Single point mutation หรือ Oligonucleotide insertion/deletion ทำให้สามารถแบ่งกลุ่ม α-Thalassemia คร่าวๆตามความผิดปกติระดับยีนได้ 2 แบบ ได้แก่ (4)
- 1. α-thalassemia due to deletion เช่น –SEA, –THAI
- 2. Nondeletion type of α-Thalassemia เช่น Constant Spring
- ความผิดปกติหลักของผู้ที่เป็นโรคโลหิตจางธาลัสซีเมียชนิดแอลฟาเกิดจากการที่สร้าง α-globin chains ได้ลดลง ส่งผลให้มีปริมาณ γ ที่เหลืออยู่มากเกินไป จับกันเป็น γ4 tetramer หรือฮีโมโกลบินบาร์ต (Hb Bart’s) ในช่วงที่เป็นทารกในครรภ์ ส่วนในช่วงวัยผู้ใหญ่จะมี β-chains หลงเหลือมากเกินไป ทำให้เกิดเป็น β4 tetramer หรือฮีโมโกลบินเอช (Hb H) การที่มีปริมาณ non-α-globin chains ที่เหลืออยู่มากเกินไปจะส่งผลเสียต่อการสร้างเม็ดเลือดแดง ทำให้เกิด intramedullary hemolysis หรือ ineffective erythropoiesis นอกจากนี้การที่มี Hb Bart’s และ Hb H จะส่งผลให้เกิดการทำลายเม็ดเลือดแดงที่โตเต็มที่ (Mature red cell) เร็วขึ้นกว่าปกติ ซึ่งทำให้เกิด extravascular hemolysis ร่วมด้วย (2, 4)
- กลุ่มอาการของธาลัสซีเมียชนิดแอลฟาสามารถแบ่งได้เป็น 4 แบบ ตามจำนวนการขาดหายไปของ α-globin (4) แสดงตามรูปที่ 1
- -Thalassemia trait มีการขาดหายไปของยีน 1 ตำแหน่ง
- -Thalassemia trait มีการขาดหายไปของยีน 2 ตำแหน่ง
- Hb H disease มีการขาดหายไปของยีน 3 ตำแหน่ง
- Hydrops fetalis with Hb Bart’s มีการขาดหายไปของยีนทั้งหมด 4 ตำแหน่ง
- ธาลัสซีเมียชนิดแอลฟาในแต่ละกลุ่มทำให้เกิดอาการและความรุนแรงที่แตกต่างกัน (3, 4) ดังนี้
- Silent carrier (-Thalassemia trait)
- ผู้ที่เป็นพาหะจะมีลักษณะเหมือนคนปกติทั่วไป เม็ดเลือดแดงขนาดปกติ (Not microcytic) ในบางครั้งอาจทราบจากการที่มีลูกเป็น Hb H disease หากอีกฝ่ายเป็น -Thalassemia trait
- α-thalassemia trait (-Thalassemia trait)
- Hb H disease
- ผู้ป่วย Hb H disease มีอาการแสดงและความรุนแรงที่หลากหลาย โดยส่วนใหญ่มักมีอาการเล็กน้อยถึงปานกลาง แต่ในบางรายอาจมีอาการรุนแรงถึงขั้นต้องได้รับการเติมเลือดเป็นประจำ และมีเพียงส่วนน้อยมากที่อาจทำให้เกิดภาวะทารกบวมน้ำตั้งแต่ในครรภ์ ผู้ป่วยอาจมีภาวะซีดอย่างรวดเร็วและรุนแรงจนต้องได้รับเลือดหากมีการติดเชื้อหรือตั้งครรภ์
- ผู้ป่วย Non-deletional Hb H พบว่ามีลักษณะอาการที่แนวโน้มรุนแรงกว่า มีปริมาณ Hb H สูงกว่า พบมีม้ามโตมากกว่า
- Hydrops fetalis with Hb Bart
- ทารกจะมีภาวะซีดรุนแรงและมีภาวะบวมน้ำตั้งแต่อยู่ในครรภ์ ทารกจะเสียชีวิตในครรภ์หรือหลังคลอด
Hb Constant Spring (3, 5, 6)
- Hb Constant Spring (Hb CS) เป็น Non-deletional α-thalassemia ที่เกิดขึ้นจาก point mutation ตำแหน่ง Stop codon ของ α2-gene (จาก TAA ไปเป็น CAA) ส่งผลให้เกิดการสร้าง α-globin chain ที่ไม่เสถียรและมีความยาวมากขึ้น เนื่องจากมีกรดอะมิโนเพิ่มขึ้น 31 ตัว
- ปริมาณการสร้าง α-globin จาก αcs allele จะมีเพียงประมาณ 1% จากปริมาณปกติ ทำให้การแสดงออกมีลักษณะคล้าย α-thalassemia
- Heterozygous Hb CS มีอาการแสดงที่ปกติ อาจไม่มีหรือมีการเปลี่ยนแปลงของเม็ดเลือดแดงเพียงเล็กน้อยเท่านั้น
- Homozygous Hb CS มีอาการแสดงคล้ายกลุ่ม Thalassemia intermedia โดยเปรียบเทียบคล้ายกับ Hb H disease ที่ไม่รุนแรง จะมีเม็ดเลือดแดงแบบ Hypochromic microcytic และมี Mild anemia, jaundice และ Hepatosplenomegaly ได้ อย่างไรก็ตามมีรายงานพบว่าสามารถเกิดภาวะทารกบวมน้ำในครรภ์ที่สัมพันธ์กับ Homozygous Hb CS ได้อีกด้วย
- ในรายที่มี Hb CS คู่กับ -Thalassemia ทำให้เกิด Non-deletional Hb H disease หรือ Hb H-CS disease ซึ่งจะมีความรุนแรงมากกว่า Deletional Hb H disease ในรายที่รุนแรงมากสามารถทำให้เกิดทารกบวมน้ำในครรภ์ได้
รูปที่ 2 ด้านซ้ายแสดง Classic α-Thalassemia syndromes ที่เกิดจากการขาดหายไปของ α-globin gene cluster ด้านขวาแสดง α-Thalassemia ชนิดฮีโมโกลบิน Constant Spring ซึ่งเป็น variant แบบ Non-deletional α-Thalassemia (3)
รูปที่ 3 แสดง Pathophysiology ของโรค Hb H disease และ Hydrops fetalis with Hb Bart’s (3)
รูปที่ 4 แสดงดัชนีเม็ดเลือดแดง (RBC indices) ในราย α-Thalassemia แต่ละรูปแบบ
ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย (mean) และ 1 SD ส่วนข้อมูล Hemoglobin และ RBC count จะแสดงข้อมูลทั้งของผู้ชาย (เส้นทึบ) และผู้หญิง (เส้นเทา) (4)
β-thalassemia
- ยีนที่ทำหน้าที่สร้าง β-globin ประกอบด้วย DNA ประมาณ 70 kb ที่อยู่บนแขนข้างสั้นของโครโมโซมคู่ที่ 11 (1) ความผิดปกติระดับยีนของ β-thalassemia โดยส่วนใหญ่เกิดจาก point mutation หากความผิดปกติทำให้ไม่สามารถสร้าง β-chain ได้เลยจะเรียกว่า-thalassemia แต่หากทำให้การสร้าง β-chain ลดลง จะเรียกว่า -thalassemia (4)
รูปที่ 5 แสดง Pathophysiology ของ β-thalassemia ที่รุนแรง (3)
- จากความผิดปกติระดับยีนของ β-thalassemia สามารถแบ่งกลุ่มตามความรุนแรงของโรคได้ดังนี้ (3, 4)
- β-thalassemia major
- ผู้ป่วยจะมีภาวะซีดที่รุนแรง ต้องได้รับการเติมเลือดอย่างสม่ำเสมอ มักมีอาการซีดเกิดขึ้นในปีแรก จะพบว่ามีตับโต ม้ามโต รูปโครงสร้างใบหน้าเปลี่ยนแปลง การเจริญเติบโตช้า ในรายที่ได้รับการเติมเลือดสม่ำเสมออาจเกิดภาวะธาตุเหล็กเกินและสะสมตามอวัยวะต่าง ๆ ได้
- β-thalassemia intermedia
- ไม่ได้มีคำจำกัดความที่ชัดเจนของกลุ่ม β-thalassemia intermedia แต่โดยทั่วไปหมายถึงผู้ป่วยที่มีระดับ Hb เพียงพอในดำเนินชีวิต โดยไม่จำเป็นต้องได้รับการเติมเลือดสม่ำเสมอ มักแสดงอาการช้ากว่ากลุ่มผู้ป่วยที่ต้องได้รับการเติมเลือดอย่างสม่ำเสมอ (มักเกินอายุ 2 ปี) ผู้ป่วยในกลุ่มนี้มีอาการและควารุนแรงที่หลากหลาย บางรายอาจพบมีภาวะแทรกซ้อนคล้ายกลุ่ม β-thalassemia major ได้ และอาจมีภาวะ Iron overload ได้แม้จะไม่ได้รับการเติมเลือดอย่างสม่ำเสมอก็ตาม (Chapter 40, Disorders of hemoglobin)
- Heterozygous β-thalassemia or Thalassemia minor or B-thalassemia trait
- รายที่เป็นพาหะจะมีเม็ดเลือดแดงที่ติดสีจางและตัวเล็ก (Hypochromic microcytic) แต่มีภาวะซีดเพียงเล็กน้อย ระดับ Hb โดยเฉลี่ยจะต่ำกว่าคนปกติประมาณ 1-2 g/dL ในช่วงตั้งครรภ์ภาวะซีดมักเป็นมากขึ้นแต่ยังคงไม่จำเป็นต้องได้รับการเติมเลือด
- β-thalassemia major
- นอกจากนี้ยังมีความผิดปกติทางโครงสร้างของ β-chain อื่น ๆ ที่สัมพันธ์กับการเกิด B-thalassemia เรียกกลุ่มเหล่านี้ว่า Thalassemic hemoglobinopathies เช่น ฮีโมโกลบินอี (Hb E)
Hemoglobin E (Hb E) (3, 4)
- ความผิดปกติเกิดจากการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสที่ตำแหน่ง Codon 26 ของ β-Globin gene จาก GAG เป็น AAG ส่งผลทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโปรตีนจาก Glutamic acid เป็น Lysine
- ฮีโมโกลบินอี (Hb E) เป็นชนิดที่มีความเสถียรลดลงเล็กน้อย (mildly unstable) ซึ่งไม่ได้ส่งผลต่ออายุขัยของเม็ดเลือดแดงอย่างมีนัยสำคัญ
- รายที่เป็นพาหะของ Hb E (Hb E trait) จะมีลักษณะการแสดงออกคล้าย β-thalassemia trait ที่มีความรุนแรงน้อยมาก (Very mild β-thalassemia trait)
- ในรายที่เป็น Homozygotes พบว่ามีเม็ดเลือดแดงขนาดเล็กลง แต่ยังคงไม่มีอาการผิดปกติ
- ในราย Compound heterozygotes ของ Hb E และ β-thalassemia (Hb E-β-thalassemia) จะมีการแสดงออกคล้ายกลุ่ม β-thalassemia intermedia หรือ β-thalassemia major ก็ได้
Laboratory diagnosis (2, 7)
การตรวจคัดกรองของธาลัสซีเมียมี 3 การทดสอบ ได้แก่
- Osmotic fragility test (OF test)
เป็นการตรวจความทนต่อการแตกสลายของเม็ดเลือดแดงในสารละลายความเข้มข้นต่าง ๆ ในสารละลายที่เป็น Hypotonic น้ำจะผ่านเข้าสู่เม็ดเลือดแดงมากชึ้น ส่งผลให้เม็ดเลือดแดงเต่งและแตก สิ่งที่เป็นปัจจัยสำคัญของความทนทาน คืออัตราส่วนพื้นที่ผิวและปริมาตรของเม็ดเลือดแดง (Surface area to volume ratio) เม็ดเลือดแดงที่มีอัตราส่วนนี้สูง เช่น Target cell และ Hypochromic cell จะแตกยากกว่าปกติ (Deceased osmotic fragility) ส่วนเม็ดเลือดแดงที่มีอัตรานี้ต่ำ เช่น Spherocyte จะแตกง่าย (Increased osmotic fragility)
การแปลผล
- Negative = ไม่เป็นธาลัสซีเมีย หรืออาจเป็นธาลัสซีเมียชนิดไม่รุนแรง เช่น α-thalassemia 2, Hb CS, Hb Pakse
- Positive = อาจเป็น α -thalassemia (α-thalassemia 1 หรือ α-thalassemia 2 บางราย) หรือ -thalassemia (-thalassemia หรือ -thalassemia ก็ได้)
หมายเหตุ
- รายที่เป็นพาหะ Hb E อาจให้ผลบวกหรือลบกับการทดสอบนี้ก็ได้
- อาจพบผลบวกลวงในรายที่เป็น Iron deficiency anemia หรือความผิดปกติอื่นๆ ที่ทำให้มี Target cell เช่น โรคตับ
- Dichlorophenolindophenol (DCIP) precipitation
Hb E เป็นฮีโมโกลบินที่ไม่เสถียร เนื่องจากเกิด mutation ของ -globin gene ตำแหน่ง Codon 26 ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนจาก Glutamine ไปเป็น Lysine ซึ่งจะถูกออกซิไดซ์ในสารละลาย DCIP และตกตะกอนได้ง่ายกว่าปกติ นอกจากนั้น ฮีโมโกลบินชนิดอื่นที่ไม่เสถียร เช่น Hb H ก็สามารถตกตะกอนเมื่อทดสอบด้วย DCIP ได้เช่นเดียวกัน
การแปลผล
Negative = ไม่มี Hb E
Positive = มี Hb E ซึ่งเป็นได้ทั้ง พาหะ Hb E หรือ Homozygous Hb E หรือ α-thalassemia / β-thalassemia ที่มี Hb E ร่วมด้วย
หมายเหตุ
- Hb H หากมีปริมาณมากจะถูกออกซิไดซ์ตกตะกอน ส่งผลให้เกิดผลบวกได้
- Red cell indices
สำหรับการคัดกรองพาหะธาลัสซีเมีย ค่าดัชนีเม็ดเลือดแดงที่นิยมใช้ได้แก่ MCV และ MCH โดยใช้เกณฑ์ MCV < 80 fL และ/หรือ MCH < 27 pg
การแปลผล
- MCV < 80 fL และ/หรือ MCH < 27 pg
อาจเป็น α-thalassemia (α-thalassemia 1 หรือ α-thalassemia 2 บางราย) และ/หรือ -thalassemia (-thalassemia หรือ -thalassemia ก็ได้) และ/หรือ Hb E
- MCV ≥ 80 fL และ/หรือ MCH ≥ 27 pg
ไม่เป็นธาลัสซีเมีย หรืออาจเป็นธาลัสซีเมียชนิดไม่รุนแรง เช่น α-thalassemia 2, Hb CS, Hb Pakse หรืออาจมี Hb E
หมายเหตุ
- พาหะ Hb E ประมาณร้อยละ 20-40 จะมีค่า MCV > 80 fL และ MCH > 27 pg
- Hb E screening test (8, 9)
พัฒนามาจากวิธี Microcolumn DEAE Sephadex A50 chromatography ในรายที่มี Hb E จะให้ผลบวกโดยจะเห็นสีของ Hb E เป็นสีแดง ส่วนรายที่ไม่มี Hb E จะเห็นเป็นสีขาว
การแปลผล
Negative = ไม่มี Hb E
Positive = มี Hb E แต่ไม่สามารถบอก Phenotype ของผู้ที่เป็น Hb E ได้
Hemoglobin typing and quantitation (2, 7, 10)
- High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) และ Low Pressure Liquid Chromatography (LPLC)
อาศัยหลักการโครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์แลกเปลี่ยนอิออนชนิดบวก (Cation exchange column chromatography) ส่วนของคอลัมน์บรรจุวุ้นซิลิกา (silica gel) ขนาดเล็ก และเคลือบสารที่มีหมู่คาร์บอกซิล (Carboxyl) ซึ่งมีประจุลบ ในส่วนนี้ทำหน้าที่เป็นตัวดูดซับหรือเรียกว่า Stationary phase โดยจะจับกับฮีโมโกลบินซึ่งมีประจุเป็นบวกที่ผ่านเข้าไปในคอลัมน์ หลังจากนั้นฮีโมโกลบินแต่ละชนิดจะถูกชะล้างออกจากคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์ หรือเรียกว่า Mobile phase ซึ่งมีความแรงของประจุสูงกว่าความแรงประจุของฮีโมโกลบินที่จับอยู่ โดยที่เครื่องอัตโนมัติจะมีโปรแกรมที่ควบคุมการผสมบัฟเฟอร์ 2 ชนิดที่มีความแรงของประจุต่างกัน เพื่อให้มีการเปลี่ยนแปลงความแรงของประจุที่เหมาะสมสำหรับฮีโมโกลบินแต่ละชนิดในเลือด
เนื่องจากฮีโมโกลบินแต่ละชนิดมีคุณสมบัติที่แตกต่างกัน ระยะเวลาที่ฮีโมโกลบินแต่ะละชนิดคงอยู่ในคอลัมน์เรียกว่า Retention time (RT) เมื่อฮีโมโกลบินถูกชะออกมาจาก Stationary phase จะถูกส่งผ่านไปยังเครื่องตรวจวัดค่าการดูดกลืนแสง หรือ Spectrophotometer detector เพื่อประมวลผลออกมาเป็น Chromatogram ซึ่งแสดงการดูดกลืนแสงของฮีโมโกลบินแต่ละชนิดที่ถูกแยกออกมาในเวลาที่ต่างกัน ร่วมกับคำนวณปริมาณของฮีโมโกลบินแต่ละชนิดจากพื้นที่ใต้กราฟออกมาเป็นร้อยละ โดย HPLC จะมีประสิทธิภาพในการแยกสารดีกว่า LPCL จึงเป็นที่นิยมใช้ในการตรวจวิเคราะห์ชนิดและปริมาณฮีโมโกลบินมากกว่า
- Capillary Electrophoresis (CE)
เป็นการวิเคราะห์โดยการแยกด้วยกระแสไฟฟ้าความต่างศักย์สูงในหลอดแก้วนำไฟฟ้าขนาดเล็กมากที่ทำด้วยซิลิกา (Silica capillary) เรียกว่า High voltage capillary electrophoresis โดยปลายทั้งสองข้างของหลอดแก้วจุ่มอยู่ในสารละลายอิเลคโตรไลท์ที่เป็นด่าง (alkali buffer) เมื่อปล่อยกระแสไฟฟ้าเข้าไปจะเกิดการเคลื่อนที่ของฮีโมโกลบินชนิดต่างๆที่มีประจุสุทธิแตกต่างกัน เคลื่อนไปตามแรงขับเคลื่อนไฟฟ้า (electro osmotic flow) ทำให้สามารถแยกชนิดของฮีโมโกลบินได้ ตัวอย่างจะถูกปล่อยจากหลอดแก้วทางด้านขั้วบวกเคลื่อนไปยังขั้วลบผ่านเครื่องการดูดกลืนแสง การรายงานผลจะรายงานออกมาเป็น Electrophoregram โดยกำหนดเป็นโซน 1 ถึงโซน 15 โดยเทียบกับตำแหน่งของ Hb A ซึ่งเป็นตำแหน่งอ้างอิงอยู่ตรงกลาง
High voltage capillary electrophoresis สามารถแยก Hb A2 ออกจาก Hb E ได้ นอกจากนี้ยังสามารถแยกชนิดและปริมาณของ Hb Bart’s และ Hb H ได้ดี ส่วนการตรวจโดย HPLC หรือ LPLC จะไม่สามารถแยก Hb A2 ออกจาก Hb E ได้ และบางเครื่องไม่รายงานปริมาณของ Hb Bart’s และ Hb H
หมายเหตุ
- เนื่องจาก Hb E อยู่ตำแหน่งเดียวกับ Hb A2 หากในตำแหน่งนี้มีปริมาณฮีโมโกลบิน > 10% ให้ถือว่าเป็น Hb E (11)
- ผู้ที่เป็นพาหะของ Hb E ที่สงสัยว่ามี α-thalassemia 1 ร่วมด้วย จะใช้เกณฑ์ที่ Hb E < 25% ดังนั้นในกรณีที่สามารถแยก Hb E ออกจาก Hb A2 หากจะใช้วินิจฉัย α-thalassemia ยังคงใช้ผลรวมของ Hb E และ Hb A2 (11)
รูปที่ 6 แสดงความหลากหลายของฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดต่างๆ ที่พบในแต่ละภูมิภาคของประเทศ โดยภาคใต้พบว่ามีความหลากหลายทางพันธุกรรมสูงที่สุด (12)
ตารางการแปลผลการตรวจ Hb typing [ดัดแปลงจาก (2, 13)]
ข้อสังเกต
- Hb typing ไม่สามารถแยกผู้ที่เป็น พาหะของ α-thalassemia 1 หรือ พาหะ α-thalassemia 2 หรือ Homozygous α-thalassemia 2 ออกจากคนปกติได้
- พาหะ β-thalassemia ที่มี α-thalassemia 1 ร่วมด้วย (Double heterozygote) อาจมีปริมาณ Hb A2 ต่ำกว่า 4% และค่า MCV อาจสูงขึ้นเป็น 78-80 fL
- Hb E trait หากพบร่วมกับ Iron deficiency anemia อาจทำให้ปริมาณ Hb E ลดลง และค่า MCV, MCH ลดลงกว่าเดิมได้ ขึ้นกับความรุนแรงของภาวะซีด (4)
การตรวจวิเคราะห์ความผิดปกติของยีนที่เป็นสาเหตุของ α-thalassemia 1 (2)
Gap PCR/agarose gel electrophoresis
Gap PCR เป็นเทคนิคที่ใช้ตรวจการขาดหายของยีนขนาดใหญ่ ร่วมกับวิเคราะห์ PCR product โดยทำ Agarose gel electrophoresis เมื่อมีการขาดหายไปของยีนจะทำให้สาย DNA สั้นลง การตรวจอาศัยการออกแบบ Primer ให้คร่อม DNA ส่วนที่ขาดหายไป หากสาย DNA สั้นลงจะสามารถเพิ่มจำนวน DNA ในส่วนนี้ได้ ส่วนคนปกติ primer ที่ออกแบบมาทั้งสองจะอยู่ห่างกันมากกว่า 17.5 kb (SEA deletion) และมากกว่า 38 kb (THAI deletion) ซึ่งมีขนาดใหญ่เกินกว่าจะสามารถเพิ่มจำนวนได้ จึงไม่มี PCR product เกิดขึ้น และเพื่อให้สามารถวินิจฉัยแยกระหว่าง Homozygous α-thalassemia 1 และ α-thalassemia 1 trait ได้ จึงมีการเพิ่ม Primer สำหรับ Normal DNA ในการทำ PCR ด้วย นอกจากนั้น เทคนิคการตรวจนี้ยังสามารถประยุกต์เป็น Multiplex Gap PCR ได้ โดยการใช้ primer หลายๆ คู่ในการตรวจหายีน α-globin ชนิดต่างๆที่ขาดหายไป ในปฏิกิริยาเดียว
รูปที่ 8 แสดง_ (14)
Relative Quantitative PCR
เป็นเทคนิคที่ออกแบบ Primer และ Probe 3 ชุด ที่จำเพาะต่อ SEA deletion, THAI deletion และยีน α-globin ปกติ โดยที่ probe แต่ละชนิดจะติดฉลากด้วยสารเรืองแสงด้วยสี Fluorescence ที่แตกต่างกัน จึงสามารถใช้ตรวจความผิดปกติของยีนผิดปกติทั้ง 2 ชนิดได้ วิธีนี้จะสามารถติดตามและจำแนกชนิดของ PCR product โดยไม่ต้องใช้การทำ agarose gel electrophoresis
การรายงานผล
- กรณีตรวจไม่พบความผิดปกติของยีน α-thalassemia 1 ชนิด SEA และ THAI รายงาน Negative for α-thalassemia 1 (SEA and THAI deletions)
- กรณีตรวจพบความผิดปกติของยีน α-thalassemia 1 ชนิด SEA รายงาน Positive for α-thalassemia 1 (SEA deletions)
- กรณีตรวจพบความผิดปกติของยีน α-thalassemia 1 ชนิด THAI รายงาน Positive for α-thalassemia 1 (THAI deletions)
การตรวจวิเคราะห์ความผิดปกติของยีนที่เป็นสาเหตุของ β-thalassemia (2)
Allele specific PCR (ASPCR)
เป็นการออกแบบ Primer ให้มีความจำเพาะกับ Mutation ชนิดใดชนิดหนึ่ง ชนิดละ 2 primer โดย primer แรกจะจำเพาะกับ Allele ปกติ และอีก primer จำเพาะกับ mutation ชนิดนั้น เมื่อนำไปทำการ PCR แต่ละ primer จะทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนยีนของ β-globin จาก allele ที่จำเพาะนั้น จากนั้นจึงตรวจดูชิ้นส่วน DNA ที่เพิ่มจึ้นมาได้ โดยการทำ Agarose gel electrophoresis ซึ่งจะสามารถแยกได้ว่า Mutation เป็นแบบ Heterozygous หรือ Homozygous
Reverse dot blot Hybridization (RDB)
เป็นการตรวจจับ DNA โดยใช้ probe ที่จำเพาะ อาศัยการออกแบบ Allele specific oligonucleotide (ASO) probe ที่มีความจำเพาะต่อยีนผิดปกติแต่ละชนิด นำมายึดติดบนแผ่น Nylon membrane ส่วน DNA ที่ต้องการตรวจ จะถูกเพิ่มจำนวนด้วยการทำ PCR และติดฉลากด้วย Biotin นำมาทำปฏิกิริยา (hybridization) กับ ASO probe บนเมมเบรนดังกล่าว แล้วตรวจสอบปฏิกิริยา Hybridization โดยการทำ color detection วิธีนี้สามารถใช้ตรวจความผิดปกติของยีน β-globin ได้หลายชนิดในการทำครั้งเดียว ถือเป็นวิธีที่สะดวกและรวดเร็ว
DNA sequencing
เป็นวิธีการตรวจหาลำดับของสารพันธุกรรม นิยมใช้วิธีของ Sanger (Sanger sequencing) โดยวิธีคือการทำ PCR เพื่อเพิ่มปริมาณ DNA ที่ต้องการตรวจหาลำดับสารพันธุกรรม สาย DNA ที่ถูกสร้างขึ้นจากการทำ PCR จะถูกจำกัดความยาวด้วย Dideoxy nucleotide ได้แก่ ddATP, ddGTP, ddCTP และ ddTTP ซึ่งจะถูกติดฉลากด้วยสารเรืองแสงด้วยสี Fluorescence ที่แตกต่างกัน และ DNA ที่ได้ก็จะมีความยาวที่แตกต่างกันตามการถูกจำกัดการสร้างโดย Dideoxy nucleotide ดังกล่าว จากนั้นเมื่อนำไปทำ Polyacrylamide gel electrophoresis ก็จะสามารถแยก DNA ที่ถูกสร้างขึ้นในขนาดความยาวที่แตกต่างกัน 1 ลำดับเบสได้ การทำ Electrophoresis โดยใช้เครื่องอัตโนมัติจะช่วยเพิ่มความสะดวกในการอ่านและแปลผลข้อมูลได้
การรายงานผล
- กรณีตรวจไม่พบความผิดปกติของยีน β-thalassemia ที่ตรวจสอบ รายงานผล Negative เช่น Negative for β-thalassemia codons 41/42 (-TTCT), codon 17 (A-T) และ IVS I-5 (C-G)
- กรณีตรวจพบ รายงานผล Positive for β-thalassemia และระบุความผิดปกติของยีนที่ตรวจพบ เช่น Positive for β-thalassemia [Codon 41/42 (-TTCT)]
- กรณีตรวจพบความผิดปกติของยีน 2 ชนิดร่วมกัน รายงานผล Positive for compound heterozygous β-thalassemia ระบุความผิดปกติของยีนที่ตรวจพบ เช่น Positive for compound heterozygous β-thalassemia [Codon 41/42 (-TTCT) and IVS I-5 (C-G)]
Prenatal diagnosis
การตรวจวินิจฉัยก่อนคลอดมีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจวินิจฉัยความผิดปกติของทารกในครรภ์ ในรายที่มีความเสี่ยงในการให้กำเนิดบุตรเป็นโรคธาลัสซีเมียชนิดรุนแรง 3 ชนิด ได้แก่ โรค Hb Bat’s hydrops fetalis, โรค Homozygous β-thalassemia และโรค β-thalassemia/Hb E โดยมีวิธีการตรวจดังนี้
- การเก็บตัวอย่างชิ้นเนื้อรก (Chorionic villi sampling: CVS)
การเก็บตัวอย่างชิ้นเนื้อรกมักทำในช่วงอายุครรภ์ 10-14 สัปดาห์ (13, 15) ข้อดีคือสามารถทราบผลได้เร็วที่สุดเมื่อเทียบกับวิธีอื่นๆ (16) มีความเสี่ยงที่จะเกิดการแท้งประมาณ 1% (13) ภาวะความผิดปกติของทารกที่สัมพันธ์กับการทำ CVS ได้แก่ Limb reduction defect และ Oromandibular limb hypogenesis เป็นต้น มักสัมพันธ์กับการทำหัตถการในช่วงอายุครรภ์น้อย หากทำเมื่ออายุครรภ์ 10 สัปดาห์ขึ้นไป ไม่ได้เพิ่มอัตราเกิดความผิดปกติดังกล่าว (16) เลือดออกกระปริบกระปรอยทางช่องคลอด (Vaginal spotting) สามารถพบได้ภายหลังการทำ Transcervical sampling เป็นภาวะที่หายเองได้และไม่ได้สัมพันธ์กับการแท้งบุตร ส่วนอุบัติการณ์ของการติดเชื้อ หรือการรั่วไหลของน้ำคร่ำพบได้น้อยกว่า 0.5% (16)
ข้อจำกัดของ CVS คือการพบ Mosaicism ซึ่งพบได้ถึง 2% ของการส่งตรวจ ซึ่งโดนส่วนใหญ่มักเป็น Confined placental mosaicism การเจาะน้ำคร่ำสามารถช่วยในการวินิจฉัยได้ โดยหากผลการเจาะน้ำคร่ำเป็นปกติ จะบ่งบอกได้ว่า Mosaicism น่าจะเป็นของรก โดย Confined placental mosaicism จะส่งผลทำให้เกิดภาวะทารกเจริญเติบโตช้าในครรภ์ได้ (Fetal growth restriction) (16) CVS culture มีโอกาสเกิดการปนเปื้อนของเซลล์มารดาสูง ดังนั้นหากขนาดตัวอย่างใหญ่พอและเหมาะสมแล้ว ควรหลีกเลี่ยงการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ นอกจากนี้ควรมีการแยกเนื้อเยื่อ Villi ออกจาก Decidua ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ เพื่อลดโอกาสเกิดการปนเปื้อนเซลล์มารดาให้น้อยที่สุด ก่อนการส่งตรวจวิเคราะห์ทาง DNA (15)
- การเจาะน้ำคร่ำ (Amniocentesis)
มักทำในช่วงอายุครรภ์ 16-18 สัปดาห์ (13) โดย Amnion และ Chorion มักจะมาแนบติดกันช่วงอายุครรภ์ 16 สัปดาห์ การทำหัตถการจึงมักทำหลังช่วงระยะนี้ (16) อัตราเสี่ยงการเกิดการแท้งประมาณ 0.5% (13) ภาวะแทรกซ้อนอื่นๆ ได้แก่ การรั่วไหลของน้ำคร่ำ หรือเลือดออกกระปริบกระปรอยทางช่องคลอด ซึ่งมีโอกาสเกิดได้ประมาณ 1-2% โดยการรั่วไหลของน้ำคร่ำมักเกิดในช่วง 48 ชั่วโมงแรกหลังการทำหัตถการ และมักจะหายได้เองภายในไม่กี่วัน และอัตราการอยู่รอดของทารกสูงเกิน 90% การรักษาแนะนำให้มีการพัก และหลีกเลี่ยงการทำกิจกรรมหนัก วิธีการทำหัตถการ (16)
วิธีการทำให้ใช้เข็มเบอร์ 20 หรือ 22 โดยเทคนิคปลอดเชื้อ (Aseptic technique) เป็น spinal needle แบบมาตรฐานความยาว 9 เซนติเมตร ทุกขั้นตอนของการทำหัตถการจะทำโดยใช้ Ultrasound เป็นตัวชี้นำ แนะนำให้เลือกแอ่งน้ำคร่ำใกล้บริเวณกึ่งกลาง (Midline) และหลีกเลี่ยงส่วนอวัยวะของทารก การแทงเข็มให้แทงตั้งฉากกับผิวหนัง เมื่อถึงชั้น Chorioamnion ให้มีการแทงโดยใช้ความแรงและความเร็วที่เหมาะสมเพื่อผ่านเข้าไปอย่างนุ่มนวล หากความเร็วในการแทงช้าอาจทำให้ amnion ถูกดึงแยกออกจาก chorion ได้ (Tenting) น้ำคร่ำที่ดูดออกมา 1-2 mL แรกอาจปนเปื้อนเซลล์ของมารดาจึงไม่ควรทำส่วนนี้ส่งตรวจ (16)
การตรวจตรวจวิเคราะห์น้ำคร่ำที่ยังไม่ได้เพาะเลี้ยงควรใช้ความระมัดระวังในการวิเคราะห์ เนื่องจากอาจมีการปนเปื้อนของเซลล์มารดา การลดการปนเปื้อนสามารถทำได้โดยการดูดน้ำคร่ำ 1-2 mL แรกออกก่อน เนื่องจากอาจปนเปื้อนเซลล์ผิวหนังของมารดา การเพาะเลี้ยงเซลล์ในน้ำคร่ำ (Amniotic cell culture) สามารถเพิ่ม DNA ของทารกได้ปริมาณมาก และช่วยลดโอกาสปนเปื้อนด้วยเนื่องจากเซลล์เม็ดเลือดขาว Lymphocyte ของมารดาเจริญจากการเพาะเลี้ยงได้ไม่ค่อยดี อย่างไรก็ตามข้อเสียของการเพาะเลี้ยงเซลล์ในน้ำคร่ำ คือต้องใช้เวลาในการทำนานขึ้น และการรายงานผลได้ช้าลง (15)
- การเจาะเลือดสายสะดือของทารก (Cordocentesis)
การเจาะเลือดสายสะดือของทารกมักทำในช่วงอายุครรภ์ 18-22 สัปดาห์ มีอัตราเสี่ยงต่อภาวะแท้งประมาณ 1% (13) นอกจากนี้อาจทำให้เกิดเลือดออกบริเวณสายสะดือประมาณ 20-30% อาจมีเลือดทารกเข้าสู่กระแสเลือดมารดา (Fetal-maternal bleeding) ประมาณ 40% และเกิดทารกหัวใจเต้นช้า (Fetal bradycardia) ได้ประมาณ 5-10% ซึ่งภาวะแทรกซ้อนโดยส่วนใหญ่มันเกิดขึ้นชั่วคราวและหายเองได้ มีส่วนน้อยที่อาจส่งผลถึงการเสียชีวิตของทารก (16)
ตารางสรุปการตรวจวินิจฉัยก่อนคลอด
Method | GA (weeks) | Pregnancy loss rate | Other complications (16) | Analysis (13) |
Chorionic villi sampling | 10-14 (13) | – 1% (13) – 1-3% (CMU 0.54%) (17) | – Limb reduction defect and oromandibular limb hypogenesis – Vaginal spotting (transcervical sampling) – Infection or amniotic fluid leakage (< 0.5%) | DNA based analysis |
Amniocentesis | 16-18 (13) 15-20 (16) | – 0.5% (13, 17) – 0.1-0.3% (16) | – Amniotic fluid leakage or transient vaginal spotting (1-2%) | DNA based analysis |
Cordocentesis | 18-22 (13) | – 1% (13, 16) – 1.4 % (17) | – Cord vessel bleeding (20-30%) – Fetal-maternal bleeding (40%) – Fetal bradycardia (5-10%) ส่วนใหญ่มักเกิดชึ้นชั่วคราว และหายได้เอง | – DNA based analysis – Hb typing |
แนวทางการตรวจวินิจฉัย (13)
- ในรายที่มีความเสี่ยงต่อการเกิดโรคธาลัสซีเมียชนิด Homozygous -thalassemia และ -thalassemia/Hb E ของทารก
- เก็บตัวอย่างชิ้นเนื้อรก หรือเจาะน้ำคร่ำ หรือเจาะเลือดสายสะดือทารก เพื่อส่งตรวจวินิจฉัยหาความผิดปกติของยีน (DNA based analysis)
- เจาะเลือดสายสะดือทารก เพื่อนำไปตรวจ Hb typing
- ในรายที่มีความเสี่ยงต่อการเกิดโรคธาลัสซีเมียชนิด Hb Bart’s Hydrops Fetalis ของทารก
- เก็บตัวอย่างชิ้นเนื้อรก หรือเจาะน้ำคร่ำ หรือเจาะเลือดสายสะดือทารก เพื่อส่งตรวจวินิจฉัยหาความผิดปกติของยีน (DNA based analysis)
- เจาะเลือดสายสะดือทารก เพื่อนำไปตรวจ Hb typing หาปริมาณ Hb Bart’s หากทารกเป็น Hb Bart’s hydrops fetalis จะพบ Hb Bart’ ปริมาณ 80-90% ไม่พบ Hb F หรือ Hb A เลย ซึ่งแตกต่างจากปกติที่ทารกควรจะพบ Hb F เป็นส่วนใหญ่
- การตรวจคลื่นความถี่สูง (Ultrasound) สามารถใช้การตรวจติดตามโดยดูลักษณะ Hydropic change ได้แก่ บวมน้ำทั่วตัว หัวใจโต น้ำในช่องเยื่อหุ้มหัวใจ น้ำในช่องท้อง ปริมาณน้ำคร่ำน้อย และรกหนา เป็นต้น โดยจะเริ่มทำตั้งแต่ในไตรมาสที่ 2 หรืออายุครรภ์ 18 สัปดาห์ขึ้นไป
รูปที่ 9 แสดงแนวทางการตรวจ Ultrasound เพื่อการวินิจฉัยก่อนคลอดในรายที่มีความเสี่ยงต่อการเกิดทารกเป็นโรค Hb Bart’s disease โดยตรวจหา Prehydropic signs ได้แก่ Fetal cardio-thoracic diameter ratio (CTR) และ Middle cerebral artery peak systolic velocity (MCA-PSV) ซึ่งแนวทางนี้มีความไว (sensitivity) เท่ากับ 100% และความจำเพาะ(specificity) เท่ากับ 89.1% ในการตรวจหา Hb Bart’s disease ของทารก [อ้างอิงจาก (18)]
รูปที่ 10 แสดงแนวทางการตรวจวินิจฉัยกรณีทารกมีความเสี่ยงในการเป็นโรคธาลัสซีเมียชนิด Homozygous β-thalassemia และ β-thalassemia/ Hb E [อ้างอิงจาก (13)]
รูปที่ 11 แสดงแนวทางการตรวจวินิจฉัยกรณีทารกมีความเสี่ยงในการเป็นโรคธาลัสซีเมียชนิด Hb Bart’s Hydrops Fetalis [อ้างอิงจาก (13)]
เอกสารอ้างอิง
- Steinberg M, Benz E, Adewoye A, Ebert B. Chapter 33-Pathobiology of the Human erythrocyte and its Hemoglobins. Hematology 7th ed Philadelphia (PA): Elsevier. 2018:447-57.
- คู่มือทางห้องปฏิบัติการการตรวจวินิจฉัยธาลัสซีเมียและฮีโมโกลบินผิดปกติ2558.
- Silberstein LE, Anastasi J. Hematology: basic principles and practice: Elsevier Health Sciences; 2017.
- Steinberg MH, Forget BG, Higgs DR, Weatherall DJ. Disorders of hemoglobin: genetics, pathophysiology, and clinical management: Cambridge University Press; 2009.
- Panyasai S, Satthakarn S, Phasit A. Effective screening of hemoglobin Constant Spring and hemoglobin Paksé with several forms of α-and β-thalassemia in an area with a high prevalence and heterogeneity of thalassemia using capillary electrophoresis. Heliyon. 2023;9(8).
- Jomoui W, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Nguyen VH, Fucharoen S. Hemoglobin Constant Spring among Southeast Asian populations: haplotypic heterogeneities and phylogenetic analysis. PLoS One. 2015;10(12):e0145230.
- Viprakasit V, Ekwattanakit S. Clinical classification, screening and diagnosis for thalassemia. Hematology/Oncology Clinics. 2018;32(2):193-211.
- Sirichotiyakul S, Tongprasert F, Tongsong T. Screening for hemoglobin E trait in pregnant women. International Journal of Gynecology & Obstetrics. 2004;86(3):390-1.
- Wanapirak C, Sirichotiyakul S, Luewan S, Srisupundit K, Tongsong T. Comparison of the accuracy of dichlorophenolindophenol (DCIP), modified DCIP, and hemoglobin E tests to screen for the HbE trait in pregnant women. International Journal of Gynecology & Obstetrics. 2009;107(1):59-60.
- Control CfD, Prevention. Hemoglobinopathies: current practices for screening, confirmation and follow-up. Association of Public Health Laboratories. 2015.
- ปุณวัฒน์ หวังรุ่งโรจน์ ไช. ความคลาดเคลื่อนในการวินิจฉัยฮีโมโกลบินผิดปกติจากเทคนิคที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์ชนิดและปริมาณฮีโมโกลบิน. วารสารโลหิตวิทยาและเวชศาสตร์บริการโลหิต. 2557;24(2).
- ขอไชย อ. คุณสมบัติของฮีโมโกลบินผิดปกติจากการตรวจวิเคราะห์ชนิดและปริมาณฮีโมโกลบิน. Journal of Health Science. 2013;22(6).
- แนวทางปฏิบัติในการตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อสนับสนุนการควบคุมและป้องกันโรคธาลัสซีเมีย2562.
- Sae-ung N, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Fucharoen S. α⁰-Thalassemia and Related Disorders in Northeast Thailand: A Molecular and Hematological Characterization. Acta haematologica. 2007;117(2):78-82.
- Li D-Z, Yang Y-D. Invasive prenatal diagnosis of fetal thalassemia. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 2017;39:41-52.
- Cunningham FG, Leveno KJ, Dashe JS, Hoffman BL, Spong CY, Casey BM. Contributing Authors. Williams Obstetrics, 26e. New York, NY: McGraw Hill; 2022.
- ธีระ ทองสง. สูติศาสตร์ เรียบเรียงครั้งที่ 6. เชียงใหม่: ภาควิชาสูติศาสตร์และนรีเวชวิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่; 2564.
- Harn‐a‐morn P, Wanapirak C, Sirichotiyakul S, Srisupundit K, Tongprasert F, Luewan S, et al. Effectiveness of ultrasound algorithm in prenatal diagnosis of hemoglobin Bart’s disease among pregnancies at risk. International Journal of Gynecology & Obstetrics. 2022;159(2):451-6.
Views: 83